TMT蛋白质组学采用Thermo Scientific（赛默飞）公司的TMT (Tandem Mass Tag)标记定量技术，通过对不同样本标记上不同的TMT标签，最终通过标签的不同实现对混合样本的区分以及定量。
TMT标签的化学结构由质量报告基团、质量平衡基团和肽反应基团构成，其中肽反应基团可以和肽段的N-term或末端赖氨酸侧链基团的游离氨基共价结合，从而使全部肽段标记上TMT标签。不同的TMT标签有不同质量的报告集团，通过质量平衡基团的平衡保持不同的TMT标签总分子质量相同。肽段在进入二级质谱时，质量报告基团因碎裂而被释放，在质谱低质量区产生报告离子峰，该质谱信号强度即反映了某一种肽段在不同样本中的相对表达量。
适用于小规模样本（≤16个）的蛋白质组学检测、分子机制研究、药物靶点研究等。
TMT蛋白质组学流程包括样本准备、实验室样本制备（含蛋白质抽提、酶解成肽段、肽段标记TMT标签、各标记肽段取等量混合为一、混合肽段分级）、上机检测（各分级肽段分别上机）、数据预处理、生信挖掘等5大环节。
1. 全面性：以整个细胞所有蛋白质为研究对象；
2. 定量准确，高可重复性：不同样本的肽段经标记后等量混合，统一分级并上机检测，避免了非标记蛋白质组学单独样本上机可能带来的误差，显著提高定量准确性和重复性；
3. 更高的鉴定深度：相比传统3D label free，蛋白鉴定数提高20~50%；鉴定能力与4D label free相当。
1. 丰富的样本处理经验，支持各类科研需求；
2. 严格的质量标准，优秀的技术检测能力，达到国际顶尖期刊报道水平；
| 项目 | 来源 | 样本数量 | 同样FDR标准下的总检出情况 |
| TMT蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学 | 文献:Chen et al., 2020,Cell 182,226-244肺癌研究 | 206个组织样本 |
10000+个蛋白
20000+个磷酸化位点 |
| TMT蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学 | 吉凯客户项目 | 120个组织样本 |
11756个蛋白
23740磷酸化位点 |
3 追求极致的报告体验，提供三套差异筛选标准结果，报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等，详情点结果示例；
4. 专业的售前售后服务，及时响应客户消息，全力解决客户问题。
吉凯基因一直致力于提供专业的蛋白质组学服务，基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析，吉凯基因蛋白质组学报告提供20多项标准分析，远超行业常规交付标准，助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效！
详情可点击往期报道：
蛋白质组学新势力| 吉凯2022版蛋白质组学分析报告重磅发布，打造行业高标准生信分析！
2023新品系列！吉凯蛋白质组学报告再更新，6大亮点助力临床科研更省心、更省力、更高效
1. 多种样本平行性及质量评价维度：从源头上把控数据质量，以提高分析结论的可靠性、可重复性
2. 三套差异筛选标准：让每套数据找到最适合的标准
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group |
P≤0.05 & FC上下调倍数 |
上调蛋白质个数（UP） |
下调蛋白质个数（DOWN） |
总差异蛋白质个数（ALL） |
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A VS B |
1.2 |
224 |
184 |
408 |
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A VS B |
1.5 |
77 |
63 |
140 |
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A VS B |
2 |
22 |
14 |
36 |
三套差异筛选结果一览表（示例）
3. 提供关键蛋白质候选列表：让临床科研更轻松、高效。
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Pretein ID |
GeneName | FC | p-value | Regulation |
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蛋白质的Uniprot ID号 |
基因名称 | 差异表达变化倍数 | t-test量著性p 值 | 上调或下调 |
| GO-BP | Go-CC | GO-MF | KEGG | GSEA-GO |
| 归属到的显著性富集GO-BP条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GO-CC条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GO-MF条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集KEGG条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GSEA-GO条目(名称&数量) |
| GSEA-KEGG | PPI degree |
Transcription factor |
Kinase | Cancer pathway related |
| 归属到的显著性富集GSEA-KEGG条目(名称&数量) | 在PPI分析中与其他蛋白连接的节点数 | 是否属于转录因子 | 是否属于激酶 | 是否属于肿瘤通路相关蛋白 |
| Pubmed文献数 | PRM预实验评估结果 | |||
| 在Pubmed中检索到的文献数 | 是否通过PRM预实验评估 |
关键蛋白质候选列表（表头示例）
4. 多种GO/KEGG富集分析方法：多角度分析，让“烂”的数据也能挖出结果
（1）基于差异蛋白质的传统富集分析方法（Fisher’s Exact Test）
（2）不依赖于差异蛋白质的GO/KEGG富集分析（GSEA分析）
5. 交互式蛋白质互作PPI：支持个性化排版，悬浮显示蛋白质的多项特征信息
6. 蛋白质动态分布范围图：展示蛋白含量高低，高低丰度一清二楚
7. 多组比较提供韦恩分析：展示多比较组的共有和特有差异蛋白质
期刊: Autophagy
影响因子:13.391
发表单位：复旦大学放射医学研究所
发表时间: 2022年8月
一、研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是世界卫生组织四级脑部恶性脑肿瘤，是最致命的人类癌症之一，多呈浸润性成长，外科手术很难做到真正的完全切除，而放射治疗可有效杀灭或者抑制残余的肿瘤细胞，因此目前临床上将术后联合放化疗作为神经胶质瘤的标准治疗方案。然而，大量报道证实GBM对电离辐射并不敏感，这也是限制患者生存率的最重要因素之一。就恶性肿瘤而言，自噬介导的细胞内分解代谢作为肿瘤对辅助放射治疗等治疗反应的促进生存过程。因此，自噬被认为是一种适应性机制，导致肿瘤获得对治疗的抗性。因而，深入开展GBM放疗耐受的调控基因及主要机制的研究，不仅可以从细胞及分子水平系统揭示辐射耐受的深层机理，更能通过靶向调控这些关键的基因或蛋白，提高临床神经胶质瘤患者放疗的疗效，有效改善患者预后。
二、研究结果
1.自噬活动在辐射抗性的GBM细胞中增强
研究者通过多阶段的X射线处理GBM U251细胞系获得了辐射抗性的细胞系U251R，但仍低于T98G的辐射抗性。随后，研究者检测了辐射抗性细胞中的自噬活动。结果表明，在辐射抗性的GBM细胞系中，辐射诱导的自噬溶酶体形成被显著增强，而抑制自噬则增强了GBM细胞对放射的敏感性。这些结果表明，GBM细胞的辐射抗性与自噬活动增强有关。
2.蛋白质组学发现辐射抗性细胞中的差异蛋白
为了寻找在参与GBM辐射抗性的关键基因，研究者使用吉凯基因提供的TMT蛋白质组学对U251、U251R，和T98G细胞进行蛋白表达谱检测，并通过U251R比U251、T98G比U251和T98G比U251R寻找差异蛋白。研究者重点关注了可能成为治疗靶点的上调蛋白。三个比较共有的上调蛋白有17个，在这其中，SDC1和TGM2同时在GBM患者中高表达，且这两个基因与差的预后相关。免疫组化染色也表明，SDC1和TGM2在对放疗不敏感的GBM组织中上调。因此，研究者将重点放到了这两个基因上。蛋白-蛋白相互作用分析表明这两个蛋白不直接关联，而临床相关的分析上，这两个蛋白的存在共表达关系。综合以上分析表明，SDC1和TGM2在辐射抗性的GBM细胞和组织中的高表达与肿瘤发展和差的预后有关。
3. SDC1和TGM2通过促进自噬体的成熟增强细胞的辐射抗性及自噬
进一步，研究者检测了SDC1和TGM2在转录和蛋白水平的表达，并发现它们在U251、U251R和T98G细胞中有序增加，即与辐射抗性呈正相关。当在细胞中干扰SDC1和TGM2的表达后，暴露于X射线的U251R和T98G细胞的存活显著降低，这表明SDC1和TGM2有助于GBM细胞的辐射抗性。
随后，研究者检测了SDC1和TGM2调控的辐射敏感性和自噬活性的关系。KEGG富集分析显示，SDC1和TGM2均参与自噬调控的途径。而当GBM细胞中的SDC1或TGM2被干扰时（siSDC1和siTGM2），在辐射后，细胞中的自噬体形成减少、LC3 II:I升高、SQSTM1降解减少，这表明自噬体成熟过程被封闭。重要的是，研究者发现SDC1和TGM2的互作促进了GBM细胞中自噬体和溶酶体的融合过程。
4. SDC1启动辐射后TGM2从细胞膜到溶酶体的转位
为了进一步理解SDC1和TGM2是如何诱导自噬体的成熟，研究者检测了GBM细胞中SDC1和TGM2的亚细胞定位。免疫荧光染色表明，在未辐射下，SDC1蛋白主要定位在细胞膜上，而TGM2一部分与SDC1定位在细胞膜上，一部分则定位在细胞核内。在4Gy辐射12h内，尤其是6h时，细胞膜上的SDC1和TGM2显著减少，而细胞浆中的SDC1和TGM2则增加。研究者排除了细胞浆中TGM2来自于细胞核的可能性。随后，研究者探究了是SDC1、TGM2还是其他蛋白启动了这种细胞浆转运。结果表明，抑制大型胞饮作用（macropinocytosis）或干扰SDC1均可以减弱辐射后SDC1和TGM2在细胞浆中的增加。进一步地，研究者通过CO-IP实验明确了SDC1和TGM2的强结合作用。随后，研究者通过表达不同结构域缺失的SDC1（质粒产品由吉凯基因提供），明确了在GBM细胞中，SDC1通过它的胞浆结构域转运TGM2至溶酶体，参与辐射诱导的自噬体成熟。
5. TGM2-LC3相互作用促进自噬体对EPG5的捕获以及含STX17的QabcR SNARE复合体的组装
研究者进一步检测了SDC1和TGM2直接结合LC3的可能性。TGM2上有两个潜在的结合LC3的结构域——WLTL和FILL，而SDC1没有。研究表明，TGM2利用其自身两个LC3相互作用区与自噬体LC3结合，促进定位于溶酶体的束缚因子EPG5与LC3结合，进而捕获自噬体并招募装配QabcR SNARE复合体（VAMP8-STX17-SNAP29），最终自噬溶酶体形成，肿瘤辐射抵抗增加。
6. 放疗（RT）和Cys-D联用可以改善GBM荷瘤小鼠的生存和病理响应
在探究完SDC1和TGM2促进GBM辐射抗性的机制后，研究者想知道一个TGM2抑制剂cystamine dihydrochloride（Cys-D）对GBM辐射敏感性的作用。Cys-D处理可以有效抑制TGM2的表达、显著提升U251R和T98G细胞的辐射敏感性。研究者构建了U251R细胞的异种原位移植瘤小鼠模型，并发现单用Cys-D治疗可以将荷瘤小鼠的中位生存时间从26天延长至32（无统计学显著性），而单独使用放射治疗（RT）可以将中位生存时间延长至44天。联合使用Cys-D和RT后，60%的小鼠在60天时仍然存活。与对照组和单一治疗组相比，联合治疗组的小鼠在15天和30天时的肿瘤体积显著减小，存活60天的联合治疗小鼠的脑部肿瘤得到有效清除。此外，联合治疗的小鼠体重增加，而对照组及单一治疗组的小鼠随着肿瘤的进展出现营养不良和恶病质。以上结果表明，TGM2抑制剂和放射治疗联合使用可作为GBM的潜在治疗选择。
三、研究总结
本研究细胞蛋白组学（吉凯基因提供）和临床病理切片分析，发现SDC1与TGM2是两个协同促进胶质母细胞瘤辐射抵抗的生物标记物，抑制SDC1与TGM2蛋白表达水平显著的增强了GBM细胞的辐射敏感性。进一步研究发现，细胞自噬水平在GBM的辐射抵抗发生发展中发挥了重要作用，而SDC1与TGM2可以通过调控自噬进程中关键“清道夫”—自噬溶酶体的形成，介导细胞的辐射抵抗。机制研究表明，肿瘤受辐射后，细胞表面的SDC1发生内化，携带TGM2转运至溶酶体，TGM2利用其自身两个LC3相互作用区与自噬体LC3结合，促进定位于溶酶体的束缚因子EPG5与LC3结合，进而捕获自噬体并招募装配QabcR SNARE复合体（VAMP8-STX17-SNAP29），最终自噬溶酶体形成，肿瘤辐射抵抗增加。临床转化研究方面，该团队发现给予口服TGM2抑制剂胱胺二盐酸盐可显著提高原位移植肿瘤的放疗缓解效果，有效延长小鼠生存期。
四、吉凯助力
吉凯基因提供了本研究中的TMT蛋白质组学分析以及质粒构建服务。
1.样本寄送流程
注意：所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。
2. 样本寄送地址
上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。
3. 取样原则
（1）代表性原则
取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。
病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。
（2）准确性原则
代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。
（3）迅速性原则
样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于蛋白质组研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
（4）低温原则
所取样本离体后，应尽快置于液氮（首选）、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。
（5）分装原则
为避免样本冻融，建议收集样本的时候对样本进行分装备份，从而保证数据质量的可靠性，检测结果的准确性。
4. 取样要求
（1）样本量要求
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样本大类 |
样本类型 |
TMT蛋白质组学送样量 |
|
细胞类 |
悬浮/贴壁细胞 |
≥5×10^6 |
|
动物 组织 |
心，肝，脾，肾，肺叶，血管等 |
≥30mg |
|
皮肤，软骨，毛发等坚硬组织 |
≥200mg |
|
|
体液类 |
血清、血浆（去高丰度蛋白，抗体亲和柱法） |
≥100μl |
|
血清、血浆（富集低丰度蛋白，纳米颗粒材料法） |
≥200μl |
|
|
血清、血浆（不去高丰度） |
≥20μl |
|
|
动物或人乳汁 |
≥2ml |
|
|
脑脊液（去高丰度蛋白） |
≥10ml |
|
|
脑脊液（不去高丰度） |
≥2ml |
|
|
关节液、淋巴液、附睾腔液 |
≥2ml |
|
|
唾液 |
≥100μl |
|
|
泪液 |
≥300μl |
|
|
尿液 |
≥15ml |
|
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其余特殊类型样本 |
细胞上清 |
≥5ml |
（2）本地样本预处理与保存建议
|
样本大类 |
样品类型 |
预处理及保存 |
|
细胞类 |
悬浮细胞 |
1. 400g-1000g离心10分钟收获细胞，弃上清； 2. 用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次，置于冰上，去上清； 3. 液氮速冻，-80℃保存。 建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解，裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题，我们需要进一步进行蛋白沉淀，这个过程可能会有一点蛋白的损失。 注意：PBS清洗时需要小心，避免细胞的损失！ |
|
贴壁细胞 |
1. 弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液； 2. 加入4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1 分钟洗涤细胞，然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液； 3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清； 4. 液氮速冻，-80℃保存。 建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解，裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题，我们需要进一步进行蛋白沉淀，这个过程可能会有一点蛋白的损失。 注意：PBS清洗时需要小心，避免细胞的损失！ |
|
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动物组织 样本 |
心，肝，脾，肾，肺叶，血管，皮肤等 |
1.首先准备好用于包装样本冷冻保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号； 2.准确切除所需组织后，立即剔除非研究所需的组织，并将组织分割成小块； 3.用镊子夹住样本，放入液氮中冷却样本； 4.放入准备好的冷冻保存管中，迅速投入液氮冷却，然后转入-80℃冰箱中保存； 5.填写样本登记单，写明临床病因及所处阶段，样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 |
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软骨等坚硬组织 |
PBS 洗涤，用手术刀将软骨切成0.5cm3 左右的小块。液氮速冻，保存在-80℃。 |
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毛发等坚韧组织 |
用适量2%SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗样品，去除污染物，干燥，保存在-80℃。 |
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体液类 |
血清 |
收集好的全血室温静置两小时，3000g 离心10min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。 |
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血浆 |
收集好的全血加入抗凝剂（可选择肝素或EDTA），室温静止30 分钟，1300g-2000g 离心10min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。 |
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动物或人乳汁 |
收集乳汁，-80℃保存。若要去除样品中的高丰度酪蛋白，需要超速离心除去。 |
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脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液 |
1000g-2000g 离心5min，（或使用0.22μm 滤膜过滤），取上清，-80℃保存。 |
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唾液 |
禁食两小时以上，9-12am 取样，1000g-2000g 离心5min，（或使用0.22um 滤膜过滤），取上清，-80℃保存。 |
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泪液 |
收集样品（可利用capillary micropipette 或Schirmer strip），8000-14000g 4度 离心5min，取上清， -80℃保存。 |
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尿液 |
5000g 4°C 离心30-60min，取上清， -80℃保存。 |
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其余特殊类型样本 |
细胞上清 |
10000g-20000g 离心30-60min，（或使用0.22um 滤膜过滤），取上清，-80℃保存，注意，应为无血清培养基。 |
5. 样本包装注意事项
（1）在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。
（2）请勿用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。
（3）请勿用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中请勿使用透明胶带。
（4）请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。
（5）标签纸应该贴于样本袋绳上，请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。
（6）请勿在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。
（7）在填写《样本登记单》时应当详细描述（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。
6. 样本储存注意事项
（1）细胞样本收集好后，立即放入-80℃保存。
（2）组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。
（3）组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用Eppendorf管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。
7. 样本运输注意事项
（1）飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。
（2）干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。
（3）运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。
（4）如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。
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