传统RNA-seq定量分析过程中，由于建库过程中PCR对片段长度和GC碱基含量的偏好 会导致部分文库片段丰度失真，进而对定量结果产生影响。UMI(Unique Molecular Identifier)分子标记则通过随机性利用不同的分子标签，标记和区分 不同的分子。绝对定量转录组测序(UMI-seq)通过在文库扩增前为每一条逆转录的cDNA添加唯一的分子标签UMI，使同一个片段扩增出来的产物均带有相同的标签，天然重复片段则带有不同的标签。利用UMI过滤数据，可一比一准确还原样本初始状态。

被唯一的随机分子标签标记的cDNA分子，在PCR、测序及后续分析过程中都携带着这个 独特的UMI标签。通过计数UMI的个数，可实现原始RNA分子的“绝对定量”。

1、可区分天然重复与扩增重复，准确识别可变剪切事件；

2、建库起始量低，200ng的Total RNA就能顺利进行mRNA/small RNAseq，更适合量 少与珍贵样品;

3、基因表达水平精准定量，避免低丰度基因丢失，可为致病及易感基因筛选等提供精准分析；

4、差异基因与Q-PCR验证一致性更高,极大缩短实验目标筛选时间。据文献报道，普通RNA-seq和miRNA-seq与Q-PCR验证的相关性为70%和35%，使用UMI建库，相关性可以达到80%以上。

1、比较转录组：要求精准的序列信息，从表达水平反应转录组进化的动态变化，并寻找潜在的驱动基因变化

2、个体机制：要求准确的mRNA、smallRNA差异基因分析，构建miRNA及其靶基因的相关调控网络

3、互作转录组：寄生类RNA表达丰度较低，可通过增加PCR循环次数提高检出率同时保证准确性

4、生物标志物：适用于起始量较低或者富集较困难样本

研究目的：利用肿瘤组织和亚型特异性生物标志物cfRNA的研究

样本信息：172个血浆样本

测序策略：UMI-mRNAseq及target RNAseq

结论：癌症样本检测到的57820个基因中，有39654（68%）的基因在正常样本中未检出；发现了12个肺癌中检测到12个DCB(dark channel biomarker），乳腺癌中检测到8个DCB，并在肺癌和乳腺癌中检测到23个cfRNA生物标志物。cfRNA可提供独特机会来检测癌症，预测肿瘤的起源组织并确定癌症亚型。

信息分析流程

差异基因聚类

我们采用主流的层次聚类对基因表达值进行聚类分析，对表达数据的行进行均一化处理。热图中表达模式相近的基因或样本会被聚集在一起，每个方格中的颜色反映的不是基因表达值，而是表达数据的行进行均一化处理后得到的数值，所以热图中的颜色只能横向比较（同一基因在不同样本中的表达情况），而不能纵向比较（同一样本不同基因的表达情况）。横向比较时，红色表示基因高表达，蓝色表示基因低表达。结果文件中既有组间的聚类，也有样品间的聚类。结题报告展示的是样品间的聚类，具体如下图所示。图中横坐标为样品名，纵坐标为差异基因FPKM归一化后的数值。

GO功能富集分析

从GO富集分析结果中，选取最显著的30个Term绘制散点图进行展示，若不足30个，则绘制所有Term，如下图所示。图中横坐标为注释到GO Term上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为GO Term，点的大小代表注释到GO Term上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。

KEGG通路富集分析

从KEGG富集结果中，选取最显著的20个KEGG通路绘制散点图进行展示，若不足20个，则绘制所有通路，如下图所示。图中横坐标为注释到KEGG通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为KEGG通路，点的大小代表注释到KEGG通路上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。

蛋白互作网络分析

可变剪接分析

可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，也是RNA-seq的重要分析内容，我们使用rMATS软件进行可变剪接分析，主要包括SE、RI、MXE、A5SS、A3SS五种可变剪接事件，如下图所示:

变异位点分析

变异位点分析是RNA-seq结构分析的重要内容，主要包括先天变异位点和后天体细胞突变位点的检测，对肿瘤等研究具有重要意义。我们使用GATK软件对样本数据进行变异位点分析，并用SnpEff软件对变异位点进行注释，其分析流程如下图所示。

送样量