免疫组库(immune repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。TCR/BCR是T/B淋巴细胞表面的特征性标志物，作用是识别抗原，基本单位都是由C/V/D/J四个基因簇编码；细胞发育过程中存在复杂的V(D)J重排机制，导致TCR/BCR基因序列多样性极其丰富，这些序列多样性的集合称为免疫组库。

传统的免疫组库研究技术通常是用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术实现，但往往只能检测TCR和BCR一条链的序列信息。10× Genomics单细胞平台，可实现高通量的单细胞转录组和单细胞V(D)J测序；可以将TCR/BCR双链完美匹配，可以细化到单细胞水平，同时获得表达谱信息。

10× Genomic单细胞免疫组库测序是利用微流控体系，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生带有UMI和barcode信息的cDNA；液体油层破裂后，cDNA一分为二，一部分用于基因表达文库的构建，一部分用于免疫组库文库构建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在TCR或者BCR、lg的C区域的巢式PCR引物进行富集。然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和TCR/BCR的V(D)J全长序列的数据，实现在单细胞水平同时对基因表达和免疫组库进行研究。

1. 通量高：有8通道和16通道的两种型号的芯片，8通道型号的芯片，一次可以实现8个样本同时上机检测，每个通道最高可以实现10000个细胞的捕获；16通道型号的芯片，一次可以实现16个样本同时上机检测，每个通道最高可以捕获20000个细胞；

2. 信息全面：可以同时获得单个细胞的mRNA信息和TCR/BCR信息。

1. 揭示克隆性、多样性、抗原特异性和细胞环境；

2. 组装并注释全长V(D)J基因序列；

3. 从单个T细胞识别α和β链序列，并可匹配TCR/BCR双链；

4. 可以将TCR/BCR与对应的细胞内的转录组信息进行合并分析。

1. 免疫组库可以捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，寻找免疫治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好的抗击肿瘤；

2. 器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主排斥反应的发生，从而发生慢性移植抗宿主病，研究其中的免疫发生过程；

3. 自身免疫免疫性疾病中免疫细胞的作用；

4. 免疫组库在感染性疾病、抗体开发、用药及疫苗评估等多个方面均有应用价值；例如通过免疫组库研究，可以检测感染类疾病过程中的免疫动态变化；

5. 在抗体开发方面，可以获得特征性的BCR（Ig）序列，缩短抗体开发的流程；

6. 针对某种疾病用药后的外周血样本进行评估，确认药物是否激发免疫反应及其功效。

研究目的： 利用单细胞RNA测序和单细胞免疫组测序技术，探索异柠檬酸脱氢酶1—IDH1(R132H)特异性肽疫苗治疗弥漫性胶质瘤的免疫应答机制；

样本信息： 发生假性进展（PsPD）患者中进行了病变切除的患者；

测序策略：10xGenomics平台，scRNA-seq+scTCR-seq；

捕获细胞数：＞16,720个细胞；

研究结论： 单细胞RNA和T细胞受体测序显示，假性进展患者的肿瘤浸润性CD40LG+和CXCL13+T辅助细胞集群由单一IDH1(R132H)反应性T细胞受体主导；表明IDH1(R132H)特异性肽疫苗可诱导特定的治疗性T辅助细胞反应 。

链配对情况

每个T细胞/B细胞通常只会产生一种TCR/Ig（免疫球蛋白） 的长链（Beta链或Delta链）/重链和/短链（Alpha链或Gamma链）/轻链的配对组合，这里统计了每个细胞的链对数和链类型配对情况

Isotyoe分析

B细胞产生的免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）有5种类型（isotype），分别为IgA，IgG，IgM，IgD，IgE。我们对不同样本中isotype频率进行统计

Clonotype多样性分析

Clonotype是指来自同一个发生过完全V(D)J重组的T/B细胞的所有增殖后代细胞的集合。我们基于Shannon指数、Simpson指数等参数计算单个样本clonotype的多样性。

Clonal expansion分析

一个clonotype对应的细胞数量> 1，表明该clonotype的祖细胞可能受到过抗原刺激，从而发生了增殖，该clonotype对应的TCR/Ig可能是能与抗原结合的关键免疫受体。

我们统计每个样本中clonotype对应的细胞数量，划分出5种增殖程度，分别为Single（细胞数=1），Small（1<细胞数≤5），Medium（5<细胞数≤20）,Large（20<细胞数≤00），Hyperexpanded（细胞数>100）。统计每种增殖程度的clonotype的数量及比例，如下图所示：

Clonal size分析

Clonal size即该clonotype对应的细胞数。我们统计了每个样本中clonal size排在前30的clonotype，然后绘制出clonal size柱状图

Public clonotype分析

Public clonotype是指TCR/Ig各条链上分别拥有相同或相似CDR3氨基酸序列的所有T/B细胞的集合。由于CDR3区域是TCR/Ig识别和结合抗原的位置，各条链上分别拥有相同或相似的CDR3氨基酸序列的细胞可能拥有结合相同抗原的能力。

对样本间共享的Public clonetype计算其在不同样本中的细胞数目，绘制成冲击图，可以比较这些Public clonetype在不同样本中的细胞数变化情况。

表位查询

表位（epitope）是存在于抗原表面，决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团，能与淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答。一些免疫受体数据库中会收录文献中研究过的免疫受体，免疫受体能结合的抗原，及抗原上的表位信息。通过与免疫受体数据库中记录的免疫受体上的CDR3序列进行比对，找到相同或相似的CDR3序列对应的免疫受体，可以获得该CDR3序列可结合的抗原及相应的表位信息，从而预测出该样本的捐献者个体体内可能出现过的抗原，或对哪些抗原可能存在潜在的免疫力，我们对所有细胞的免疫受体进行表位查询

免疫组库&单细胞转录组联合分析

1. 基于细胞类型的链配对情况-柱状图

2. 基于细胞类型的链配对情况-UMAP图

3. Isotype着色图展示

4. Clonal expansion程度着色图展示

5. Clonal size着色图展示

免疫组库&T/B细胞亚群联合分析

1. 基于细胞亚群的链配对情况-柱状图

2. 基于细胞类型的链配对情况-UMAP图

3. Clonotype多样性分析

4. 不同细胞类型Clonal expansion程度统计，例如CD8 T细胞

5. Clonal expansion细胞数统计

6. Isotype分析

7. Clonal expansion程度着色图展示

8. Clonotype追踪分析