单细胞Mix测序产品是基于10x Genomics和BD Rhapsody平台，利用寡核苷酸偶联的抗体或脂质体结合的特征寡聚体条形码孵育不同的样本，为不同的样本标记上不同的标签，然后将多个样本混合在一起，按照单一样本文库制备的流程，进行一次建库操作，然后上机测序，实现多样本混样单细胞测序。

BD混样产品原理图

通过一个通用的PCR手柄和poly(a)尾，每个样品标签可被beads捕获，然后使用针对PCR手柄区域的2个Sample-Tag特异性引物以及BD Rhapsody试剂进行PCR扩增

10x混样产品原理图

1. 消除批间差异：生物学重复的样本一次建库，同时上机，可有效的去除批间差异；

2. 样本通量大：一次可以做多个样本（至少2个）；

3. 性价比高：相比单个样本建库测序，由于是多个样本混样后一次建库，极大的节省了建库费用，使得每个样本的成本大幅下降。

1. 必须要能够同时送2个样本以上；

2. 可能存在细胞数捕获偏差，混样样本数越多可能偏差越大；

3. 需要的实际样本量大，一般起始细胞量＞1*10⁵，因为样本抗体标记的过程中需要多次清洗；

4. 双细胞率可能比单个样本捕获的时候高；

5. 原始数据不可拆分成单样本，但是不影响后续的结果展示。

研究目的：利用单细胞RNA测序（scRNA- seq）剖析人类免疫细胞群异质性的性能

样本信息：3个流式分选得到的T细胞亚群样本

测序策略：BD平台，单细胞混样测序

捕获细胞数：9708个细胞

结论：绘制了人类初级CD4 T细胞的高分辨率地图，并确定了血液和组织中Th1、Th17和调节性T细胞（Treg）分化的精确轨迹

研究目的：利用单细胞RNA测序（scRNA- seq）评估继发于高氧的正常肺部组织或受损的肺部组织的发育过程

样本信息：36只小鼠的肺组织

测序策略：10x平台，单细胞混样测序

捕获细胞数：＞66,000个细胞

结论：该研究描述了高氧暴露的多个方面，并确定了作为支气管肺发育不良的潜在药物靶点的病理路径-方式

质量控制

质控是指通过一系列参数尽量排除双细胞、死细胞、多细胞的过程。基于质控后的数据进行的后续分析更准确。

细胞分群及注释

细胞分群是依据基因表达量对细胞进行分类的过程，基于标志基因等方式，确定细胞类型是后续各种研究的基础。

标志基因可视化

标志基因可视化气泡图常用于展示多个基因在不同细胞群中的平均表达水平，同时展示该细胞群中表达该基因的细胞所占的比例。

细胞组成分析

细胞组成分析关注属于每个细胞特征群的细胞比例,该比例可能随着疾病的发生或发育进程而发生改变。

细胞亚群分析

细胞亚群分析是指将关注的细胞拿出，再次进行分群的过程。细胞亚分群使得大家可以在更细的颗粒度研究科学问题，例如小鼠中性粒细胞可以被分为G0细胞、G1细胞、G2细胞等（Xie, X., Shi, Q., Wu, P., Zhang, X., Kambara, H., Su, J., ... & Luo, H. R. (2020). Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature immunology, 21(9), 1119-1133）。

拟时序分析

伪时间分析（pseudotime analysis）是指通过计算细胞间基因表达量的渐变关系，预测所有细胞在一条或多条虚拟的时间线上的先后顺序，构建出细胞的发育或分化轨迹。常用于发育过程的样本，或药物处理后的时间序列样本，可以用于找到随时间变化，或在发育或分化节点起关键作用的核心基因。

细胞时序变化：

细胞类型变化：

随伪时间变化的关键基因：

随伪时间变化的基因热图：

细胞通讯

细胞通讯（cell communication）是指细胞接收、处理和传递与环境和自身的信号的能力，它是每个生物体 （如细菌、植物和动物）中所有细胞的基本属性。CellPhone/CellChat可基于数据库&基因表达量推断不同细胞类型间存在的系统通讯关系。

细胞间通讯强度：

配受体分析：

转录因子调控

转录因子（Transcription Factor, TF）是指通过结合基因上游特异核苷酸序列，进而调控该基因转录的蛋白质。多个转录因子协调，驱动基因表达，构成了复杂的转录因子调控网络，这些调控网络影响了细胞的增值、分化甚至疾病的发生。基于pySCENIC，我们可以推断单细胞转录组数据中存在的转录因子及其靶基因，并构建调控网络，以直观查看基因表达调控关系。

RNA velocity分析

基于对RNA分子是剪接的还是未剪接（即仍包含内含子序列的新生RNA）的评估。RNA velocity能够预测给定细胞未来的基因表达状态。

伪时间变化：

细胞类型变化：

inferCNV分析
InferCNV可以用于肿瘤单细胞RNA-Seq数据中鉴定大规模染色体拷贝数变异，例如整个染色体或大片段染色体的扩增或缺失

GSEA

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis/GSEA）通过评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献。

GSVA
基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis / GSVA)，是一种非参数的无监督分析方法，主要用来评估转录组的基因集富集结果。