空间转录组是指通过一次实验可得到样本的mRNA表达信息，并且可以比对到相应的H&E染色图像，达到图像化和数字化的高度整合分析。空间转录组学分析可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路， 完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组被广泛用于肿瘤、发育生物学、神经科学等多领域，为肿瘤异质性、肿瘤微环境、复杂疾病的机制解析提供新的见解。

空间转录组的核心在于独特的捕获芯片，正式文库构建的芯片上有4个捕获区域（6.5mm X6.5mm，可以加4个样本），每个捕获区域含有约5000个被条形码标记的点（barcoded spots），每个spot直径55μm，spot与spot中心点之间的距离为100μm，每个spot含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针，每个探针上都带有独特的spatial barcodes，用以标记捕获的mRNA的空间位置。

针对FFPE样本的特殊性，10x Visium目前针对小鼠（1.8万个基因）和人（2万个基因）的基因数据库设计了探针，每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增，RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片上的探针捕获结合，通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，然后透化释放连接的probe，完成信息捕获过程（FFPE样本不需要针对不同类型的样本摸索透化条件，所有的样本类型都用同样的透化条件）。

捕获的probe在玻片上进行延伸反应，生成cDNA，回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。载玻片上的每个捕获区域都有一个oligo阵列，每条oligo上包含与probe结合的捕获探针，该oligo同时具备描述空间信息的标记性序列。

基于探针设计捕获方式，FFPE样本文库构建大小在240bp左右，不同于冰冻组织450-470bp；测序深度在25k reads pair/per spot左右即可满足分析需要，不同于冰冻组织50k reads pair/per spot的要求。

FFPE样本探针杂交链接

1. 样本收集灵活：石蜡包埋样本，可以长期储存；

2. 分辨率高：每个捕获区域有5000个mRNA捕获点；

3. 时效性高：实现远程全息数字切片扫描实时交流；

4. 样本兼容范围：人和小鼠组织都可以建库；

5. 专业的组织透化方案：FFPE样本不需要进行透化预实验的摸索，透化条件统一；

6. 结果可验证性强：当前常用的实验手段，比如免疫荧光等可轻松验证实验结果。

研究目的：使用空间转录组学检测肾细胞癌(RCC)中肿瘤三级淋巴器官（TLS）内B细胞反应的性质

样本信息：24个ccRCC原发性肿瘤（冷冻样本（n=12）&FFPE切片（n=12））

测序策略：10xGenomics平台，单细胞空间转录组（ST）+Bulk RNAseq

捕获细胞数：NA

结论：B细胞在TLS中富集，在TLS中可以识别B细胞成熟到浆细胞(PC)形成的所有阶段。B细胞组库分析显示TLS的克隆多样化、选择、扩增和远端完全成熟克隆型的存在。在TLS+肿瘤中，产生IgG和IgA的PC沿着成纤维细胞轨道扩散到肿瘤床中。TLS+肿瘤表现出高频率产生IgG的浆细胞以及IgG染色、凋亡的恶性细胞，提示其抗肿瘤活性。免疫检查点抑制剂治疗的RCC患者的治疗反应和无进展生存率与IgG染色的肿瘤细胞相关。

质量控制

这里通过Number of Genes，Total Counts，Percentage of Mitochondrial Counts对每个样本的质控指标进行统计，由于空间转录组的特殊性（重点关注切片染色基因的表达分布），不对spot点进行过滤。

Spot分群

Spot分群是依据基因表达量对spot进行分类的过程，spot分群是后续各种研究的基础。

标志基因发现和富集分析

标志基因发现是指通过差异分析计算特定群高表达基因的过程。

富集分析是寻找上述高表达基因富集的通路的过程。

特征评分

特征评分是指基于特定基因集计算该基因集在不同群的表达情况。

1. 石蜡包埋的FFPE样本包埋后低温保存（4℃或者-20℃），4℃冰袋运输

2. 样本处理和运输过程需要在低温环境，FFPE样本冰袋运输

3. 如果样本充足，建议准备≥2份样本，一份用于RNA质控和正式切片实验，一份留作备用

吉凯承接过的部分空转样本