扩增子测序（16s/18s/ITS）是对特定长度的PCR产物或捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。可研究样本中属水平以上 的微生物群落组成及其丰度差异

16S/18S/ITS等扩增子测序即通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，以研究环境微生物多样性及群落组成差异。16S/18S rDNA为编码原/真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。ITS分为两个区域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。

扩增子测和宏基因测序对比

1. 生长发育过程中肠道微生物的变化规律

2. 饮食结构对肠道微生物的影响

3. 疾病对肠道菌群的影响

4. 药物治疗不同阶段肠道微生物的变化规律

研究目的：探索肝细胞癌（HCC）患者肠道微生物组特征并评估微生物组作为HCC非侵入性生物标志物的潜力

样本信息：419例患者的粪便样本

测序策略：16s扩增子测序

结论： 从健康到肝硬化，粪便微生物菌群多样性下降,从肝硬化到早期HCC，菌群多样性增加。 与健康个体相比，早期HCC患者中产丁酸的细菌菌属减少，生成脂多糖的菌属增加。建立含30个菌群标志物的诊断模型，诊断准确性较高，并在中国不同地域的患者样本中得到验证。

分析流程

物种注释

1. OTU分析

为研究各样本的物种组成，对所有样本的Effective Tags，以97%的一致性（Identity）进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释。根据聚类得到OTUs结果和研究需求，分析不同样本（组）之间共有、特有的OTUs，当样本（组）数小于5时，绘制成韦恩图（Venn Graph），当样本（组）数大于5时，会展示花瓣图。韦恩图和花瓣图的绘制是对所有样本进行均一化处理之后进行的。

2. 物种丰度聚类热图

根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图，便于发现哪些物种在哪些样本中聚集较多或含量较低。结果展示如下：

样本复杂度分析（Alpha Diversity）

Alpha Diversity用于分析样本内（Within-community）的微生物群落多样性[7]，通过单样本的多样性分析（Alpha多样性）可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性，包括用物种累积箱形图、物种多样性曲线和一系列统计学分析指数来评估各样本中微生物群落的物种丰富度和多样性的差异。

1. 物种多样性曲线

稀释曲线（Rarefaction Curve）和等级聚类曲线（Rank Abundance）是常见的描述组内样本多样性的曲线。

2. 物种累积箱形图

物种累积箱形图（species accumulation boxplot）是描述随着样本量的增加物种多样性增加的分析，是调查样本的物种组成和预测样本中物种丰度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于样本量是否充分的判断以及物种丰富度（species richness）的估计。因此，通过物种累积箱形图不仅可以判断样本量是否充分，在样本量充分的前提下，运用物种累积箱形图还可以对物种丰富度进行预测（默认在样本量大于10个时分析）。

多样本比较分析（Beta Diversity)

Beta Diversity是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。

1. 距离矩阵热图

Beta多样性研究中，选用Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离两个指标来衡量两个样本间的相异系数，其值越小，表示这两个样本在物种多样性方面存在的差异越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离绘制的Heatmap展示结果如下：

2. PCA分析

应用PCA分析， 能够提取出最大程度反映样本间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进而揭示复杂数据背景下的简单规律。如果样本的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。基于OTU水平的PCA分析结果展示如下：

功能预测

1. 功能相对丰度聚类分析

根据样品在数据库中的功能注释及丰度信息，选取丰度排名前35的功能及它们在每个样品中的丰度信息绘制热图，并从功能差异层面进行聚类。

2. 功能注释PCA分析

基于数据库的功能注释的丰度统计结果进行PCA降维分析，如果样品的功能组成越相似，则它们在降维图中的距离越接近:

3. 功能注释Venn图或花瓣图

为了考察指定样品（组）间的基因数目分布情况，分析不同样品（组）之间的基因共有、特有信息，绘制了韦恩图(Venn Graph)或花瓣图，展示结果如下:

样本量

取样建议

一、粪便样本采集

1)准备好便盆和粪便容器,洗手,带上手套收集新鲜的粪便样本;

2)在实验室将装好受试者粪便样本立即放在冰上进行分装并标记;

3)用无菌牙签、勺子或粪便取样器截取样品中段里部(粪便表层含有肠粘膜脱落细胞),外部容易污染,且接触空气后,部分细菌DNA开始降解;

4)样品采集时建议将样品按照一次提取的量进行分管保存，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解;每管可收集分装1克(建议3g)，置于5ml EP或15ml、50ml离心管中，取样完毕后盖上盖子旋紧，用封口膜封口，尽可能保持样品处于厌氧环境(如有条件可以使用厌氧袋);

5)分装好后,若当天提取DNA,可以先放4°C,长期存放需先迅速放入液氮中,之后立即放入-80°C保存，避免反复冻融;

6)寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证开箱验收时有足够干冰剩余。 注:如粪便样品量较多或不能马上收集,最迟要在2小时之内全部收集完

二、肠道内容物样品采集

1)在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物(条件允许的话，可在无菌操作台进行);

2)用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记;

3)用灭菌离心管分装，单个样本取样量: 200-500mg/管为保证实验顺利 进行，每个样本取多管备份，在采样允许的情况下，尽量多采集样品;

4)分装好后，若当天提取DNA,可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存;

三、肠道组织样本采集

组织样本用无菌磷酸盐缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出;用无菌的显 微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行DNA的提取;长期存放需先迅速放入液 氮中，之后立即放入-80°C保存

四、皮肤表面样本采集

将生理盐水浸湿的无菌棉签按在取样表面上,用力使其弯曲与擦拭表面成45度,平稳而缓慢地擦拭取样表面。翻转棉签,让棉签的另一面也进行擦拭,但与前次擦拭移动方向垂直,取样位置应避免与微生物取样点重复。擦拭完成后,将每个取样点的棉签头剪下集中放入同一支样品接收试管中,塞子塞紧密封,每个样本保存2-3个拭子,所有样本均需-80°C保存。

五、牙菌斑样本采集

采样前2h受检儿童禁食，用无菌生理盐水漱口，棉卷隔湿，用无菌牙科刮 器刮取封闭剂边缘菌斑和邻近健康光滑牙釉质表面的菌斑，即刻放入含1ml液体硫 乙醇酸盐(Fluid Thioglycollate,FT)的1.5ml无菌离心管中，于-80°C保存。

六、鼻咽拭子样品采集

1)咽拭子:明亮的光线从检查者肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，再用洁净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，然后将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。

2)鼻拭子:尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻聘处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。

注意事项:1)咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。2)取样时间最好在发病72小时内，晨起后。3)鼻腔和咽部样品，可只收集一种，也可同时收集2种并混合。

七、眼部分泌物样本采集

首先使用无菌生理盐水/TSB等预先湿润无菌棉拭子(注意尽量在管壁上挤 压去掉多余液体);采样时(包括左眼和右眼)撑开眼睑，用无菌湿拭子醮取分泌物，避免接触睫毛和脸缘，必要时可使用开睑器;采样后将样本放置于-80度冷冻保存。

八、人肺泡灌洗液(BALF)

1)1%的利多卡因对患者进行口咽部局部麻醉，静脉推注咪达唑仑5mg;

2)患者取仰卧位，予吸氧、心电血压监测;

3)用支气管镜行支气管肺泡灌洗术，经气管镜活检孔注入1%利多卡因局部麻醉，将气管镜嵌入右肺中叶或左肺上叶舌段的一个亚段，共注入120mL加热至37°C的生理盐水，50mL注射器回收，尽快4°C运送回实验室;

4)分装后高速离心，15600×g 4°C离心30min，弃上清，细胞沉淀-80°C冻 存备用。

九、尿液样本采集

取标本前要洗手，以及实施其它必要的清洁措施，尿液收集容器应贴有标签， 并核对信息，留取所需实验的最小样本量(5ml)，取标本时避免污染，取好后， 将容器盖好，防止尿液外溢，并记录标本留取时间，放于-80° C保存。