5-甲基胞嘧啶(m5C),在RNA中广泛分布，早在上世纪70年代就已发现存在于mRNA上，但由于技术的局限性，一直没有得到充分研究。m5C RNA修饰的检测，采用基于抗体富集的甲基化RNA免疫沉淀测序方法（MeRIP-seq），该技术利用m5C特异性抗体富集发生m5C修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，对RNA上的m5C修饰进行定位与定量，可以在全基因组范围内精确检测RNA的m5C甲基化修饰，全面解析m5C在转录组的分布及变化，帮助科研人员深入理解RNA甲基化在生命和疾病中的作用，促进疾病的精准诊断与治疗研究。

1. 全面覆盖编码和非编码RNA的m5C化甲基化修饰

2. 样本要求低：通过优化打断条件，提高IP效率，改进洗脱条件等可微量建库

3. 同时适用于细胞株和临床样本

4. 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域

1. 测序平台:Illumina Nova Seq 6000

2. 测序模式:PE150

3. 测序数据:12G（IP 6G+Input 6G）

研究目的：通过m5C RNA甲基化测序探索参与I型干扰素反应的RNA甲基转移酶或去甲基化酶的功能

样本信息：HEK293T细胞

测序策略：m5C-meRIP-seq+m5C-Bis-seq+RNAseq

结论：鉴定出m5C甲基转移酶NSUN2在多种不同病毒感染期间负调控I型干扰素应答反应，包括SARS-CoV-2、ZIKV、SeV、VSV以及HSV-1。NSUN2特异性介导IRF3 mRNA的m5C甲基化并加速其降解速率，导致IRF3表达水平及其介导的下游IFN-β产生水平降低。在细胞水平和小鼠水平上，敲低或敲除NSUN2显著增强I型干扰素应答和病毒感染后下游ISGs表达。在IRF3 mRNA中鉴定了NSUN2结合和修饰的高甲基化位点，NSUN2可以通过主要的胞嘧啶位点特异性地甲基化IRF3 mRNA。 NSUN2通过加速IRF3 mRNA的快速周转作为干扰素反应的负调控因素，而在SARS-CoV-2和各种病毒感染期间，内源性NSUN2水平下降以促进抗病毒反应，有效地消除病毒。

GO富集分析

GO（Gene ontology）是国际通用的基因功能分类体系，按照基因的细胞成分（cellular component），分子功能（molecule function）以及生物过程 （biological process）分为3类。进行GO富集能够看到样本在这三大类中的基因分布情况，也可以用于对目标功能的基因的聚集。通过计算数据集的超几何分布，得出基因富集对应GO terms的排序。

KEGG富集分析

随着科学研究的发展，科学家们发现不同的基因间存在着相互作用关系。这 些基因相互协调，发挥其生物学功能，展现出生物学现象。针对这一现象，科学 家们分门别类的制定出各种pathway。较为著名的有KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库。

样本量

采样方法

一、贴壁细胞
1. 取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好;
2. 加入3ml的1×PBS(RNase-free水配制)悬起细胞沉淀，300g离心5min，弃PBS，洗2次;
3. 加入适量裂解液反复吹打至裂解充分;参考用量:1mL TRIzol裂解106细胞，最多107细胞；
4. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份;
5. 转移至尖底离心管中，-80°C长期保存或通过干冰运输寄出。

二、悬浮细胞
1. 选取生长状态良好的细胞悬液;
2. 200g离心5min，得到细胞沉淀弃培养基;
3.  加入3ml的1×PBS(RNase-free水配制)悬起细胞沉淀，200g离心5min，弃PBS，洗2次;
4. 加入适量细胞裂解液反复吹打至裂解充分;参考用量:1mL Trizol裂解106细胞，最多107细胞；
5. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份;
6. 转移至尖底离心管中，-80°C长期保存或通过干冰运输寄出。

三、组织样本
1. 选取新鲜的动物组织，取材后用RNase-free配制的生理盐水/PBS进行漂洗，去除血渍和污物，并剔除结缔组织等非研究组织;
2. 在冰上将样品分割成50mg左右的小块，以防止样品降解，然后放置于细胞冻存管或1.5ml EP管中;
3. 所有动物组织样品取材后立即用液氮速冻≥1h，然后转移至-80°C冰箱中保存;
4. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份;
5. 然后将组织样品置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输。

注意事项:
1. 细胞必须裂解充分后再寄送，勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放内源性RNAse,从而降解RNA；
2. 细胞裂解是否充分很关键，细胞裂解充分的标志:细胞与裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液体，且没有细胞团块残留，如果细胞样品始终粘度很大，说明该细胞样品仍未裂解充分，此时应继续补加裂解液，以100ul为梯度进行补加，直到样品完全裂解充分；
3. 细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞会释放RNase导致RNA降解。